柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名茈胡，列為上品，至《本草圖經(jīng)》始易其名為柴胡，距今已有2000多年的應(yīng)用歷史，臨床上常用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛等癥狀[1, 2]。柴胡的藥用價(jià)值及療效決定了其應(yīng)用范圍的廣泛性，成為中藥材市場中的主要流通品種之一。
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2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”和“南柴胡”[3]。然而，近年來柴胡屬的大多數(shù)植物均在實(shí)際應(yīng)用中作藥用，使用品種混亂，其質(zhì)量也是連年下降。
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柴胡屬藥材的使用在我國大概可分為3類：北柴胡類、紅柴胡類和竹葉柴胡類[4]。
北柴胡常見的混淆品種有銀州柴胡Bupleurum yinchowense Shan et Y. Li、小葉黑柴胡Bupleurum smithii var. parvifolium Shan et Y. Li、錐葉柴胡Bupleurum bicaule Helm等；
南柴胡、錐葉柴胡等又可稱為“紅柴胡”，南柴胡現(xiàn)在的產(chǎn)量很少，市場上流通的多為錐葉柴胡（市場上稱為“海拉爾柴胡”）；
竹葉柴胡類多分布在西南地區(qū)，常作藥用的主要有膜緣柴胡Bupleurum marginatum?Wall. ex DC. 及其變種窄竹葉柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC.?var. stenophyllum?(Wolff) Shan et Li. [5]。
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柴胡屬植物的化學(xué)成分十分復(fù)雜，迄今為止已報(bào)道含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、黃酮、甾醇、多糖等多種成分。皂苷是柴胡屬植物中的主要化學(xué)成分，也是發(fā)揮藥效的重要部分，主要包括柴胡皂苷-a、-c 和-d[6, 7]。不同的柴胡品種其有效成分含量相差懸殊，如果混用勢必會(huì)導(dǎo)致臨床藥效不穩(wěn)定，因此，有必要對柴胡屬的易混藥材品種進(jìn)行鑒別研究。
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性狀、顯微、理化等方法多用于易混淆藥材品種的鑒別，具有操作簡單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[8-10]。然而，來源為同屬的中藥材及飲片，性狀較為相似，這給傳統(tǒng)鑒定帶來了不小的困擾，DNA 條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段鑒定物種的新技術(shù)[11]，鑒定方法快速、準(zhǔn)確，鑒定結(jié)果不受植物的生長發(fā)育階段和性狀特征等因素的影響，可作為傳統(tǒng)鑒定方法的科學(xué)佐證。
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本研究收集到柴胡屬北柴胡、南柴胡、竹葉柴胡、藏柴胡及錐葉柴胡共5種易混藥材，其中北柴胡有野生和家種之分，結(jié)合形態(tài)特征及薄層色譜方法對這5種藥材進(jìn)行了鑒別研究，并采用ITS2片段的DNA分子鑒定方法進(jìn)行基因序列的測定，為柴胡屬5種藥材的鑒別提供了科學(xué)依據(jù)。
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1.實(shí)驗(yàn)樣品及試劑（略）——詳情請見文獻(xiàn)
2.實(shí)驗(yàn)方法（略）——詳情請見文獻(xiàn)
3.1藥材性狀鑒別
3.1.1北柴胡
野生北柴胡呈圓柱形或長圓錐形。長6~15 cm，直徑0.2~1.2 cm，根頭部膨大，頂端殘留2至數(shù)十個(gè)莖殘基，有時(shí)可見少數(shù)短纖維狀葉基，下部多有分枝。表面棕褐色或灰棕色，有縱皺紋、皮孔及支根痕。質(zhì)硬而韌，不易折斷，斷面顯片狀纖維性，形成層呈多個(gè)同心環(huán)排列，皮部薄，淺棕色，木部黃白色。氣微香，無敗油氣，味微苦辛。見圖1A，圖2A。
家種栽培北柴胡與野生北柴胡的區(qū)別主要在于形狀上較為順直，根頭部膨大的不明顯，分枝較少，表面顏色較淺，斷面形成層環(huán)狀排列不明顯。見圖1B，圖2B。
3.1.2南柴胡
根呈長圓錐形，較細(xì)。長5~12 cm，直徑0.2~0.5 cm，近根頭部有多數(shù)細(xì)而緊密的環(huán)紋，根頭頂部密被纖維狀葉基殘余和1~3個(gè)莖殘基，下部極少分枝。表面棕紅色或棕褐色，具縱皺紋及皮孔。質(zhì)稍軟而脆，易折斷，斷面略平坦，不顯纖維性。略具敗油氣，味微苦辛。見圖1C，圖2C。
3.1.3竹葉柴胡
根多呈紡錘狀，細(xì)長，下端常成扭曲狀。頂端殘留數(shù)個(gè)莖基和葉基，莖基部有密集的節(jié)，根頭部有時(shí)可見密集的環(huán)紋，稀分枝。表面黃棕色或棕褐色，有縱皺紋，皮孔明顯。質(zhì)堅(jiān)韌，不易折斷，折斷面顯纖維性。氣清香，味微苦辛。見圖1D，圖2D。
3.1.4藏柴胡
根細(xì)長圓錐形，彎曲。長達(dá)18 cm，直徑0.1~0.6 cm，近根頭部殘留1~3個(gè)莖基，莖基部有密集的節(jié)，有時(shí)下部有分枝。表面灰褐色或黃棕色，具細(xì)皺縮，可見皮孔及支根痕。質(zhì)柔韌，不易折斷，斷面略顯纖維性，皮部較厚呈黑棕色環(huán)。氣濃郁，久嚼微具辛辣味，有刺喉感。見圖1E，圖2E。
3.1.5錐葉柴胡
根呈長圓錐形，較直。根頭部膨大，殘留多數(shù)粗細(xì)不一的莖基和棕黑色毛刷狀纖維，根上部較粗，近根頭部處常有鼓起，下部多不分枝或稍分枝。表面黑褐色或略帶紅棕色，皮孔大，凸出，橫向排列。質(zhì)硬脆，易折斷，斷面平坦，不顯纖維性，栓皮層易剝落，皮部淡棕色，木部黃白色，多見放射狀紋理呈“菊花心”樣。略具敗油氣，味微甜略有胡蘿卜味。見圖1F，圖2F。
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3.1.6 柴胡屬5種藥材性狀簡易檢索表
為便于以上5種藥材的鑒別，作者根據(jù)藥材性狀特征編制了檢索表。見表2。
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3.2薄層色譜鑒別
從薄層色譜圖可以看出，不同種柴胡均含有柴胡皂苷d。其中錐葉柴胡（S20~S22）和其他幾種差別較大，在Rf=0.9的位置上有一個(gè)明顯的綠色斑點(diǎn)，其他幾種均沒有。8個(gè)批次的市售柴胡（飲片），各批次間斑點(diǎn)數(shù)量、Rf值及顏色較為接近，和2批山西家種北柴胡（S4~S5）也較為一致，僅少數(shù)斑點(diǎn)所表現(xiàn)出的含量有所差別。野生北柴胡（S1~S3）和南柴胡（S14）斑點(diǎn)顏色比家種的淺一些，和對照藥材較為一致。竹葉柴胡（S15~S16）和藏柴胡（S17~S19）在斑點(diǎn)數(shù)量、Rf值和顏色上均與北柴胡沒有大的差別，說明這兩種在成分類群組成上和《中國藥典》收載的正品柴胡比較接近。
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3.3DNA條形碼鑒別
建樹法是DNA條形碼鑒別方法中較為直觀地反映物種水平分辨效果的方法，能有效地為不同類群物種鑒定提供依據(jù)。如圖4所示，從構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可知，本研究中22個(gè)樣本的ITS2序列分別與GenBank序列聚為一支，該鑒定結(jié)果與性狀鑒別結(jié)果相吻合，從側(cè)面驗(yàn)證了本研究中藥材基原鑒定的準(zhǔn)確性。另一方面，5個(gè)柴胡屬物種分別各自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。因此ITS2序列可用于這5種柴胡藥材的物種鑒定。
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4.小結(jié)與結(jié)論
柴胡是比較復(fù)雜的品種，除了柴胡屬不同品種藥材性狀較為接近難以準(zhǔn)確區(qū)分外，因資源量的影響及地區(qū)習(xí)用情況的不同，市場上出現(xiàn)的品種也很多，這對臨床使用的穩(wěn)定性造成了影響，甚至以前出現(xiàn)過有毒的大葉柴胡Bupleurum longiradiatum?Turcz.也做柴胡用的情況，因此對各個(gè)品種做到準(zhǔn)確鑒別至關(guān)重要。本研究收集了《中國藥典》中收載的北柴胡和南柴胡以及地方習(xí)用品種竹葉柴胡、藏柴胡和錐葉柴胡，通過性狀、薄層色譜及DNA條形碼的方法對上述各品種進(jìn)行了鑒別研究。
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從藥材性狀上分析，北柴胡（家種和野生品）質(zhì)較硬，根頭部無或少有毛狀葉殘基；南柴胡和錐葉柴胡根頭部均有多數(shù)毛狀葉殘基，斷面不顯纖維性，具敗油氣，其中南柴胡近根頭部有多數(shù)細(xì)而緊密的環(huán)紋，表面棕紅色或棕褐色，味微苦辛，錐葉柴胡表面黑褐色或略帶紅棕色，栓皮層易剝落，斷面多見放射狀紋理呈“菊花心”樣，味微甜有胡蘿卜味；竹葉柴胡和藏柴胡表面顏色較淺，莖基部有密集的節(jié)，質(zhì)堅(jiān)韌，不易折斷，斷面略顯纖維性，其中竹葉柴胡氣清香，味微苦辛，藏柴胡皮部較厚呈黑棕色環(huán)，氣濃郁，久嚼微具辛辣味，有刺喉感。因此從性狀特征上可以把這5個(gè)品種予以鑒別區(qū)分。
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從薄層色譜圖上可以明顯看到，錐葉柴胡和其他幾種差別較大，在Rf=0.9的位置上有一個(gè)明顯的綠色斑點(diǎn)，其他幾種均沒有，因此，本研究建立的薄層方法能夠快速、準(zhǔn)確地把錐葉柴胡與其他幾個(gè)品種區(qū)別開。竹葉柴胡和藏柴胡在斑點(diǎn)的數(shù)量、Rf值及顏色上均與正品柴胡沒有大的差別，本實(shí)驗(yàn)的薄層方法無法把此兩種柴胡與藥典品柴胡準(zhǔn)確區(qū)別開。
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中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(BLAST)的ITS2序列比對結(jié)果表明，ITS2序列可以準(zhǔn)確區(qū)分柴胡屬這5個(gè)物種?；贗TS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明，北柴胡、南柴胡、竹葉柴胡、藏柴胡及錐葉柴胡均可各自聚為一支，5種柴胡可以明顯區(qū)分。傳統(tǒng)鑒定與分子鑒定相結(jié)合用于中藥材及飲片的鑒定是比較富有潛力的新方法，DNA條形碼技術(shù)為藥材基原鑒定提供了一種輔助手段，是傳統(tǒng)鑒別方法的有效補(bǔ)充[13]。
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綜上所述，5種藥材從性狀特征上能夠準(zhǔn)確予以區(qū)分；薄層色譜結(jié)果顯示，錐葉柴胡和其他幾種柴胡區(qū)別較大，能夠快速鑒別，竹葉柴胡及藏柴胡與正品柴胡較為一致；分子鑒定結(jié)果表明ITS2序列可用于5種柴胡藥材的物種鑒定，且快速、準(zhǔn)確。
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有學(xué)者[14]研究竹葉柴胡，認(rèn)為單從藥效成分測定結(jié)果來看，竹葉柴胡完全符合《中國藥典》的法定要求。在2010年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[15]中收載了竹葉柴胡，用藥部位為全草，目前，四川、云南等西南地區(qū)除使用《中國藥典》規(guī)定的兩個(gè)品種外，還習(xí)用竹葉柴胡及其變種藏柴胡等入藥，且《滇南本草》[16]中收載有柴胡，據(jù)圖和文字描述，與竹葉柴胡和藏柴胡的基原一致。柴胡資源日益減少，南柴胡在市場上已經(jīng)很難見到量大的貨，地區(qū)習(xí)用品種竹葉柴胡和藏柴胡使用歷史悠久，資源量比較豐富，化學(xué)成分類群和正品柴胡也很一致，是否能把這兩者作為《中國藥典》中柴胡的補(bǔ)充品種，需要我們在藥效學(xué)方面做更多系統(tǒng)的對比研究，以便合理地進(jìn)行評價(jià)，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
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文獻(xiàn)來源：《中藥材》雜志，《柴胡屬5種易混藥材的鑒別研究》
作者：丁錘, 徐瑩, 馬孝熙, 王志鵬, 毛雯雯, 張?zhí)m蘭
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參考文獻(xiàn)
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